微塑料的海洋污染在近幾年得到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的普遍關(guān)注[1-2]。微塑料通常是指直徑小于5 mm的塑料碎片、顆粒及纖維，根據(jù)形成途徑的不同，可將其分為兩種類型：初級(jí)微塑料(工業(yè)直接制造的直徑小于5 mm的原生微塑料，如帶有磨砂顆粒的潔面乳、洗衣粉以及牙膏等)和次級(jí)微塑料(較大體積塑料在風(fēng)力、潮汐等機(jī)械作用和紫外線輻射下，破碎、分解形成的二次微塑料)[3]。研究表明，目前微塑料已經(jīng)遍布全球[4-5]，在大西洋東北部發(fā)現(xiàn)微塑料密度為2.46個(gè)·m-3[6]。
微塑料對(duì)海洋生物的影響研究目前主要集中在濾食性動(dòng)物(如橈足類、貽貝、牡蠣、磷蝦)和蟹、魚(yú)等[7-12]。用熒光標(biāo)記的微塑料研究表明，微塑料可以被海洋生物攝入腸道內(nèi)，附著在口器、附肢等[9]。微塑料造成的“飽腹感”會(huì)降低海洋生物對(duì)餌料的攝食，從而導(dǎo)致能量攝入的不足，進(jìn)一步影響其生殖功能[13]，如Sussarellu等[10]用聚苯乙烯微球?qū)μ窖竽迪牨┞秲蓚€(gè)月，牡蠣卵母細(xì)胞的數(shù)量、直徑和精子速度顯著下降，同時(shí)被暴露的牡蠣后代的產(chǎn)量和發(fā)育也分別有所下降。除了攝食和生殖活動(dòng)，微塑料還會(huì)干擾海洋生物的內(nèi)分泌，對(duì)生長(zhǎng)、性發(fā)育、繁殖能力產(chǎn)生一定的影響[1, 14]。附著在體表的微塑料會(huì)引起海洋生物游泳等行為的不適，影響其生理活動(dòng)。微塑料并非只是單純的進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)再排泄出而不引起其他變化，實(shí)驗(yàn)證明紫貽貝攝食微塑料后，會(huì)在其腸道和消化道中累積，進(jìn)一步從腸道轉(zhuǎn)移到循環(huán)系統(tǒng)[7-8]。
目前國(guó)內(nèi)學(xué)者也開(kāi)展了關(guān)于中國(guó)近海微塑料的分布、轉(zhuǎn)移以及對(duì)海洋生物的影響研究[2, 15-19]。Sun等[2]以東海浮游動(dòng)物為研究對(duì)象，系統(tǒng)地研究了10個(gè)浮游動(dòng)物類群微塑料的特征、生物累積濃度和殘留率，對(duì)微塑料的殘留和特征進(jìn)行了系統(tǒng)地論述。武芳竹等[12]研究發(fā)現(xiàn)魚(yú)類攝入微塑料后會(huì)存在于其體內(nèi)組織和器官，對(duì)其生殖、發(fā)育、代謝、神經(jīng)系統(tǒng)以及內(nèi)分泌等都會(huì)有一定的影響。微塑料對(duì)海洋生物可能會(huì)產(chǎn)生兩種損傷，一種是物理?yè)p傷，另一種是化學(xué)損傷[15]。物理?yè)p傷是指微塑料會(huì)阻礙生物進(jìn)行攝食和消化，對(duì)腸道帶來(lái)一定的傷害；化學(xué)損傷是指微塑料和有機(jī)污染物結(jié)合后被攝入生物體內(nèi)所帶來(lái)的傷害。微塑料由于具有大的比表面積、疏水性較高，容易與一些重金屬離子、持久性有機(jī)污染物(POPs，如多氯聯(lián)苯、滴滴涕、壬基酚等)相互作用并結(jié)合在一起，從而對(duì)海洋生物造成聯(lián)合毒性效應(yīng)[20]。
海洋橈足類在食物鏈以及海洋生態(tài)系統(tǒng)中具有重要的地位和作用，目前雖然已有少量關(guān)于微塑料對(duì)海洋生物的生態(tài)學(xué)影響的相關(guān)研究，但微塑料對(duì)海洋橈足類攝食生態(tài)、行為的影響及其作用機(jī)理目前尚不清楚。聚酰胺-6(Polyamid 6，簡(jiǎn)稱PA 6，俗稱尼龍6)是由己內(nèi)酰胺聚合而成的塑料材料，被廣泛應(yīng)用于纖維、工程塑料及薄膜三大領(lǐng)域[21]，同時(shí)也被廣泛應(yīng)用于汽車行業(yè)、電子電器市場(chǎng)、家用電器等領(lǐng)域，是目前囯內(nèi)外產(chǎn)量最大，應(yīng)用范圍最廣的一種聚酰胺材料。針對(duì)目前微塑料對(duì)海洋橈足類影響的研究不足，我們將海洋橈足類短期暴露于微塑料尼龍6中，研究微塑料對(duì)其攝食、排泄和生殖的影響，進(jìn)而分析微塑料對(duì)橈足類的生態(tài)學(xué)及海洋食物網(wǎng)的影響。
1 材料與方法1.1 浮游植物以三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)作為橈足類的餌料，在溫度為(18 ± 1)℃、光照為60 μmol·m-2·s-1、光周期為12 L: 12 D的條件下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后待用。培養(yǎng)藻的海水為經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾的pH為8.1、鹽度為32的海水，在0.1 MPa條件下高壓滅菌20 min，冷卻后加入f/2培養(yǎng)基。
1.2 海洋橈足類選用猛水蚤(Harpacticus sp.)作為實(shí)驗(yàn)材料，猛水蚤是膠州灣、匯泉灣海水中常見(jiàn)的底棲橈足類。猛水蚤于2018年11月用200目小型浮游動(dòng)物網(wǎng)采自青島魯迅公園潮間帶，暫養(yǎng)于2 L塑料桶中，帶回實(shí)驗(yàn)室，立即挑取活潑成體進(jìn)行培養(yǎng)。以濃度為10×104 cells·mL-1的三角褐指藻作為餌料，鹽度調(diào)節(jié)至30，在室溫下培養(yǎng)。取其健康活潑的子代雌體為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。
1.3 微塑料聚酰胺-6(Polyamid 6，簡(jiǎn)稱PA 6，俗稱尼龍6)顆粒，粒徑為5~20 μm，購(gòu)自Sigma Aldrich公司，光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡照片見(jiàn)圖 1。
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圖 1 尼龍6微粒的光學(xué)顯微鏡(A)和掃描電鏡(B)照片Fig. 1 Image of nylon 6 beads in optical microscope (A) and scanning electron microscope (B) |
根據(jù)Rehse等[22]設(shè)置的微塑料實(shí)驗(yàn)濃度，設(shè)置尼龍6濃度梯度為0、12.5、25、50、100和200 mg·L-1 6個(gè)濃度梯度，每個(gè)濃度梯度不加橈足類(對(duì)照組)和加橈足類(實(shí)驗(yàn)組)各設(shè)置3個(gè)平行樣。在100 mL聚碳酸酯(PC)瓶中裝滿餌料濃度為15×104 cell·mL-1的三角褐指藻藻液，每個(gè)瓶中加入10只猛水蚤。固定在轉(zhuǎn)速為1 r·min-1的攝食輪上，防止藻沉底。實(shí)驗(yàn)前，猛水蚤饑餓馴化24 h。猛水蚤攝食24 h后測(cè)定餌料濃度，濾水率和攝食率按照Frost[23]的公式進(jìn)行計(jì)算：
| F =(V/N)×(lnCt ? lnCtf)/t, G = F×(Ctf ? C0)/(lnCtf ? lnC0)。F =(V/N)×(lnCt ? lnCtf)/t, G = F×(Ctf ? C0)/(lnCtf ? lnC0)。 |
式中：F—濾水率(mL·ind-1·h-1)；G—攝食率(cells·ind-1·h-1)；V—實(shí)驗(yàn)海水體積(mL)；N—猛水蚤數(shù)量(ind)；t—攝食時(shí)間(h)；Ctf—實(shí)驗(yàn)組(加橈足類)最終餌料濃度(×104 cell·mL-1)；Ct—對(duì)照組(不加橈足類)最終餌料濃度(×104 cell·mL-1)；C0—起始餌料濃度(×104 cell·mL-1)。
1.5 排糞率、糞便顆粒體積及沉降速率的測(cè)定攝食24 h后，用光學(xué)顯微鏡觀察并計(jì)數(shù)糞便顆粒，單只動(dòng)物產(chǎn)生的糞便顆粒數(shù)即為排糞率(ind·copepod-1·d-1)。糞便顆粒尺寸用目鏡測(cè)微尺測(cè)定，并根據(jù)形狀(橢球體)計(jì)算糞便顆粒的體積。按照Cole等[24]的方法進(jìn)行糞便沉降速率的測(cè)定，即在裝滿滅菌海水的奈斯勒比色管(高37.5 cm，直徑2 cm)管壁上每隔1 cm用記號(hào)筆作上標(biāo)記，室溫下將糞便顆粒用吸管吸入、輕輕放入海水中并馬上計(jì)時(shí)，每個(gè)處理5個(gè)平行樣，計(jì)算糞便顆粒的平均沉降速率(m·d-1)。
1.6 抱卵率的測(cè)定實(shí)驗(yàn)選用饑餓72 h未抱卵的猛水蚤雌體，以保證實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)所有猛水蚤雌體生殖狀態(tài)基本相同。尼龍6濃度梯度設(shè)置與1.4部分相同，每一個(gè)濃度梯度設(shè)置3個(gè)平行樣，每個(gè)實(shí)驗(yàn)PC瓶中裝滿15×104 cells·mL-1的三角褐指藻藻液，每只瓶中挑入10只未抱卵的成熟雌體，每天記錄抱卵數(shù)并更新一半藻液，同時(shí)將已經(jīng)抱卵的雌體挑出，并計(jì)算抱卵率。
1.7 半數(shù)效應(yīng)濃度(Median effect concentration，EC50)的測(cè)定微塑料尼龍6對(duì)猛水蚤攝食率、濾水率、排糞率、糞便體積和沉降速率以及抱卵率的抑制率(Inhibition ratio，IR)按照公式IR(%)=(1-T/C)×100%計(jì)算，其中T和C分別為微塑料處理組和對(duì)照組(0 mg·L-1)的攝食率、濾水率、排糞率、糞便體積、糞便沉降速率或抱卵率，并利用概率單位法計(jì)算半數(shù)效應(yīng)濃度EC50。
1.8 數(shù)據(jù)處理每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)平行樣(糞便沉降速率為5個(gè)平行)，取平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。采用t—檢驗(yàn)檢測(cè)數(shù)據(jù)結(jié)果間的顯著性差異。
2 結(jié)果2.1 攝食率和濾水率猛水蚤的攝食率(變化范圍：0.317×104~1.169×104 cells·ind-1·h-1)和濾水率(變化范圍：0.018 7~0.070 4 mL·ind-1·h-1)變化趨勢(shì)類似，在暴露微塑料尼龍6 24 h后，攝食率和濾水率比對(duì)照組(無(wú)微塑料)降低，且均隨著微塑料濃度的增大而逐漸降低(見(jiàn)圖 2)。與對(duì)照組的攝食率和濾水率相比，微塑料濃度200 mg·L-1時(shí)的猛水蚤的攝食率和濾水率分別降低了72.9%和73.4%。微塑料尼龍6對(duì)猛水蚤攝食率和濾水率的24 h·EC50分別為67.7和62.2 mg·L-1。
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圖 2 不同濃度微塑料尼龍6對(duì)猛水蚤攝食率和濾水率的影響Fig. 2 Effects of different concentrations of microplastic nylon 6 on ingestion rate and clearance rate of Harpacticus sp. |
暴露微塑料24 h后，猛水蚤的總排糞率比對(duì)照組(無(wú)微塑料)降低，且隨著微塑料濃度增加而逐漸降低(見(jiàn)圖 3)。與對(duì)照組的總排糞率(17.8 ind·copepod-1·d-1)相比，暴露在微塑料濃度為200 mg·L-1的猛水蚤總排糞率(8.5 ind·copepod-1·d-1)降低了52%。另外，微塑料的存在使猛水蚤排出的糞便顆粒與對(duì)照組的糞便顆粒相比尺寸變小，正常糞便平均尺寸為220 μm× 25 μm，異常糞便平均尺寸為31 μm× 21 μm(見(jiàn)圖 4)。形狀由長(zhǎng)橢球體變?yōu)槎绦E球體(見(jiàn)圖 4)，且隨著微塑料濃度的增大，每天每只猛水蚤排出的長(zhǎng)橢球體的糞便數(shù)目越來(lái)越少(由17.4個(gè)降為4.9個(gè))，而異常糞便(短小橢球體狀)數(shù)目逐漸增多(由0.4個(gè)升高到3.6個(gè))(見(jiàn)圖 3)，隨著微塑料濃度的升高，異常糞便占總糞便的百分比由2%逐漸升高到42%。微塑料尼龍6對(duì)猛水蚤總排糞率和正常排糞率的24 h·EC50分別為221.2和84.1 mg·L-1。
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圖 3 不同濃度微塑料尼龍6對(duì)猛水蚤排糞率的影響Fig. 3 Effect of different concentrations of microplastic nylon 6 on pellet production rate of Harpacticus sp. |
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圖 4 暴露于200 mg·L-1微塑料尼龍6攝食24 h后猛水蚤的糞便顆粒Fig. 4 Fecal pellets of Harpacticus sp. after exposure to 200 mg·L-1 microplastic nylon 6 for 24 h |
糞便顆粒的體積和沉降速率均隨著微塑料尼龍6濃度的增大而降低，對(duì)照組中猛水蚤正常糞便的平均體積為7.2 × 104μm3，平均沉降速率為269 m·d-1，暴露于200 mg·L-1微塑料尼龍6中24 h后，異常糞便的平均體積為1.01 × 104 μm3，平均沉降速率為31 m·d-1(見(jiàn)圖 5，6)，后者的糞便體積和沉降速率分別比前者降低了86.5%和88.5%，均存在極顯著差異(P < 0.01)。微塑料尼龍6對(duì)猛水蚤糞便體積和糞便沉降速率的24 h·EC50分別為86.4和50.2 mg·L-1。
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圖 5 暴露于微塑料尼龍6攝食24 h后猛水蚤的糞便體積Fig. 5 Volume of fecal pellets in Harpacticus sp. after exposure to 200 mg·L-1 microplastic nylon 6 for 24 h |
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圖 6 暴露于微塑料尼龍6攝食24 h后猛水蚤糞便的沉降速率Fig. 6 Sinking rate of fecal pellets in Harpacticus sp. after exposure to 200 mg·L-1 microplastic nylon 6 for 24 h |
微塑料暴露使猛水蚤抱卵延遲導(dǎo)致抱卵率降低(見(jiàn)圖 7)，而且微塑料濃度越大，抱卵率降低幅度越大，在第6天，微塑料濃度為0、12.5、25、50、100和200 mg·L-1的猛水蚤的抱卵率分別為80%，50%，40%，35%，30%和20%。微塑料尼龍6對(duì)猛水蚤抱卵率的48、72、96、120、144 h EC50分別為35.3、20.9、63.1、61.3和30.3 mg·L-1。
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圖 7 不同濃度微塑料尼龍6對(duì)猛水蚤抱卵率的影響Fig. 7 Effects of different concentrations of microplastic nylon 6 on the proportions of gravid female in Harpacticussp. |
來(lái)源：中國(guó)海洋大學(xué)
