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條斑紫菜單孢子形成相關(guān)基因(PyMFG)的特性及其表達(dá)差異（一）
發(fā)布日期：2020-04-23

條斑紫菜隸屬于紅藻門(Rhodophyta)、原紅藻綱(Protoflorideae)、紅毛菜目(Bangiales)、紅毛菜科(Bangiaceae)、紫菜屬(Pyropia)[1]。主要分布于中國黃海、渤海和東海北部沿岸以及日本和朝鮮半島，是中、日、韓三國共同栽培的紫菜種類，其產(chǎn)業(yè)在中國及世界海藻產(chǎn)業(yè)中占有重要的經(jīng)濟(jì)地位[1]。條斑紫菜利用絲狀孢子體和葉狀配子體完成世代交替，此外，其可通過放散單孢子的形式進(jìn)行無性生殖，為海區(qū)生產(chǎn)提供了大量次級苗源[2]?，F(xiàn)有研究表明，Pyropia屬紅藻單孢子的形成與放散一定程度上影響了藻體的大小與數(shù)量，最終決定了其產(chǎn)量[3]。

目前研究表明，溫度、光照、營養(yǎng)鹽、海水密度等培養(yǎng)條件的改變均可影響單孢子的形成與放散[4-7]。此外，尿囊素、硫酸銨等外源物質(zhì)的添加對單孢子的放散亦具有重大影響 [6, 8-9]。早期研究發(fā)現(xiàn)，甲基硝基亞硝基胍(MNNG)可誘導(dǎo)野生型的條斑紫菜U-511產(chǎn)生大量放散單孢子的色彩突變體[2]。然而，近年來，隨著紫菜誘變育種技術(shù)的不斷深入，學(xué)者們利用60Co γ射線對大量放散單孢子的印度產(chǎn)紫菜(P. chauhanii)野生型品系(PC-WT)進(jìn)行誘變，進(jìn)而分離出不放散單孢子且經(jīng)過數(shù)代培養(yǎng)后可穩(wěn)定遺傳的印度產(chǎn)紫菜PC-Y1品系[10]，這表明單孢子的形成和放散是由基因決定的。此外，條斑紫菜的營養(yǎng)細(xì)胞在特化為單孢子的過程中，單孢子細(xì)胞的cDNA電泳條帶明顯減少，說明其遺傳信息的表達(dá)發(fā)生了明顯變化[11]。Kitade等認(rèn)為，營養(yǎng)細(xì)胞在特化為單孢子時，參與卡爾文循環(huán)的差異基因顯著性表達(dá)[12]；此外，孫迪等[8]證實培養(yǎng)液中外源尿囊素的添加亦可促進(jìn)單孢子的大量放散。以上結(jié)果說明，單孢子的形成和放散與能量、嘌呤代謝通路密切相關(guān)。

本研究通過對條斑紫菜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性搜索和基因注釋查找，篩選到一條與構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)分生孢子形成基因(abaA)(GneBank登錄號：AN0422.2)的同源序列(Contig-21827)，二者編碼的氨基酸序列同源性為54.22%。經(jīng)研究證實：構(gòu)巢曲霉的分生孢子是借由特化的分生孢子梗經(jīng)有絲分裂發(fā)育而來，新分裂出的單倍體個體與母細(xì)胞具有相同的基因型，成熟釋放至合適環(huán)境中能發(fā)育為兩個獨立的真菌個體；紫菜屬的單孢子是由配子體上的營養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)有絲分裂特化發(fā)育而來，新的單孢子苗攜帶的遺傳信息與營養(yǎng)細(xì)胞完全相同且游離的單孢子可以獨立發(fā)育成完整植株。由此可見，條斑紫菜單孢子形成與子囊菌門(Ascomycota)真菌分生孢子的產(chǎn)生極為相似。本實驗類比構(gòu)巢曲霉分生孢子形成通路和兩者的遺傳模式進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)該基因與條斑紫菜單孢子的形成相關(guān)性極大，將其命名為PyMFG。

本研究旨在通過RT-PCR技術(shù)克隆得到PyMFG基因的ORF全長并對其進(jìn)行一系列生物信息學(xué)分析，以期為進(jìn)一步開展條斑紫菜在工程菌中的表達(dá)研究與開發(fā)合理放散單孢子的紫菜新品種奠定基礎(chǔ)。

1.   材料與方法

1.1   實驗材料

本實驗所用的條斑紫菜為4個雜交重組品系(PY26W、PY26W'、PY26R、PY26R')，由其野生型品系(U-511，父本)與大量放散單孢子的紅色突變體(fre-1，母本)雜交產(chǎn)生的色塊分離純化而來，突變體的獲得方法詳見Yan[2]，分離純化方法同劉美君等[[14]。絲狀體促熟后，刺激其放散殼孢子作為后續(xù)實驗材料。葉狀體的培養(yǎng)條件：(19±1) °C，40 μmol photons/(m2·s)，10 L∶14 D，每5天更換1/2的培養(yǎng)液。培養(yǎng)液為添加MES培養(yǎng)基、比重為1.020的滅菌海水。取以上品系培養(yǎng)至日齡為25、30、35 d時的葉狀體，用蒸餾水清洗干凈后置于液氮中速凍3~5 min，最后保存至-80 °C冰箱備用。此外，收取日齡35 d的野生型圓紫菜(PS-WT)、印度產(chǎn)紫菜(PC-WT)、壇紫菜(WT-8)用做熒光定量PCR驗證的材料，其培養(yǎng)溫度為(23±1) °C，其他培養(yǎng)條件同上。

1.2   單孢子放散

將條斑紫菜4個重組品系(W、R、W'、R')的殼孢子培養(yǎng)至日齡為20 d時，分別挑選3組大小一致、長勢相同的30棵葉狀體用作后續(xù)實驗。首先，每組葉狀體置于白色塑料杯中充氣培養(yǎng)，翌日用滅菌的鑷子取出并放置于盛有新鮮培養(yǎng)液的新塑料杯中繼續(xù)培養(yǎng)。舊塑料杯中的單孢子置于其適合的生長條件下，待其肉眼可見時，用滅菌毛筆刷下并統(tǒng)計各品系每株葉狀體的單孢子日放散量，連續(xù)統(tǒng)計15 d后獲得單孢子總放散量，以此確定條斑紫菜不同品系的單孢子放散能力。

1.3   條斑紫菜RNA提取及cDNA制備

采用Trizol試劑法[15]提取條斑紫菜不同品系的葉狀體總RNA。首先，取0.1~0.3 g紫菜葉狀體，液氮迅速研磨后轉(zhuǎn)入含有1 mL Trizol試劑(Ivitrogen公司)的除酶離心管中。4 °C，12 000×g離心10 min后，向上清液中加入200 μL氯仿抽提，然后經(jīng)4 °C，12 000×g離心10 min，再次吸取上清液并加入等體積異丙醇離心獲得RNA沉淀。然后加入1 mL75%的乙醇(DEPC水配)洗滌沉淀2次，最后在超凈工作臺中風(fēng)干5 min，用適量無RNase 水溶解RNA。取1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以此為模板進(jìn)行后續(xù)實驗。Trizol試劑購自Ivitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于TaKaRa公司，其它藥品均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。

1.4   條斑紫菜PyMFG基因ORF全長序列克隆

本研究通過對條斑紫菜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行同源性搜索和基因注釋查找，篩選到一條長1 314 bp的單孢子形成相關(guān)基因PyMFG。利用ORF Finder (HYPERLINK http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/htaml)在線預(yù)測該基因的ORF區(qū)后采用NCBI Primer Blast在其ORF區(qū)分別設(shè)計上、下游引物PyMFG F、PyMFG R，引物序列詳見表1。

表 1

表 1 PyMFG ORF驗證與熒光定量PCR引物

25 μL PCR反應(yīng)體系為Premix rTaq 酶12.5 μL，模板1 μL，無RNase 水10.5 μL，上、下游引物各0.5 μL。程序設(shè)置為94 °C預(yù)變性5 min，94 °C變性30 s，60 °C退火30 s，72 °C延伸2 min，最后72 °C延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測、膠回收純化(南京諾唯贊)后與pMD-19T載體連接并轉(zhuǎn)入大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆后送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，測序引物為M13通用引物。Premix rTaq酶、無RNase水、載體、感受態(tài)細(xì)胞均購于TaKaRa公司，LB培養(yǎng)基購于上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.5   生物信息學(xué)分析

PyMFG序列分析

開放閱讀框(open reading frame, ORF)分析：根據(jù)ORF Finder預(yù)測PyMFG的開放閱讀框，獲取其編碼蛋白的氨基酸序列。蛋白質(zhì)組成分析：應(yīng)用在線分析工具(https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam)分析蛋白質(zhì)的組成、疏水性、分子量和等電點。蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析：應(yīng)用PredictProtein(https://www.predictprotein.org)對PyMFG的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測。蛋白質(zhì)跨膜區(qū)分析：應(yīng)用TMHMM Server v.2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)對蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)進(jìn)行預(yù)測。功能位點與結(jié)構(gòu)域分析：應(yīng)用PROSITE數(shù)據(jù)庫(https://prosite.expasy.org/)對蛋白質(zhì)序列的功能位點進(jìn)行預(yù)測；應(yīng)用InterProScan(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析。亞細(xì)胞定位分析：應(yīng)用TargetP 1.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)預(yù)測該蛋白在胞內(nèi)的位置。應(yīng)用NCBI Blastp搜索獲得PyMFG所編碼氨基酸的同源序列并用Bioedit軟件進(jìn)行同源性分析。應(yīng)用 MEGA7.0根據(jù)鄰近法(Neighbor Joining)和最大似然法(Maxmiun Likehood)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

條斑紫菜PyMFG蛋白的空間結(jié)構(gòu)模擬

將條斑紫菜PyMFG蛋白序列提交至Swiss-Model進(jìn)行建模，得到條斑紫菜PyMFG 蛋白的3D結(jié)構(gòu)模板4ln0。從PDB數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org/)下載4ln0單體結(jié)構(gòu)，使用Pymol軟件將預(yù)測的PyMFG結(jié)構(gòu)與數(shù)據(jù)庫中的4ln0單體結(jié)構(gòu)進(jìn)行擬合，模擬PyMFG中相應(yīng)氨基酸的空間位置。

1.6   實時熒光定量PCR

根據(jù)已經(jīng)得到的cDNA序列，利用NCBI Primer Blast在線設(shè)計熒光定量PCR的上、下游引物PyMFG qRT-F和PyMFG qRT-R(表1)。根據(jù)壇紫菜18S rRNA序列設(shè)計上、下游引物PH18S F和PH18S R(表1)，利用Bio-Rad CFX-96以及SYBR I熒光染料(TaKaRa)完成熒光定量PCR實時檢測，程序設(shè)置同Koramutla[PH18S作為內(nèi)參基因，W品系作為對照組，按照2?△△Ct法計算基因的相對表達(dá)量。定量結(jié)果為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，應(yīng)用Origin 8.5軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，并采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)和最小顯著差異法(LSD)比較不同數(shù)據(jù)組間的差異，P<0.05表示差異顯著。

2.   結(jié)果

2.1 PyMFG部分序列驗證

1%的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1所示，PyMFG基因的開放閱讀框全長1 224 bp。其編碼的氨基酸序列如圖2所示，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA。

圖 1

圖 1 條斑紫菜PyMFG基因全長ORF擴(kuò)增電泳圖

圖 2

圖 2 條斑紫菜PyMFG基因編碼的氨基酸全長序列

2.2   PyMFG蛋白特性分析

條斑紫菜PyMFG蛋白的特性分析結(jié)果如表2所示，該蛋白的分子量為46.24 ku，等電點為9.08，分子式為C2064H3257N559O616S15。此外，該蛋白含有較多的絲氨酸與大量疏水性氨基酸。其中，Ile占9.1%、Pro占7.4%、Leu占6.4%、Phe占4.7%、Val占4.2%、Tyr占3.7%、Met占2.2%、Trp占0.5%，總體約占氨基酸總數(shù)的42.4%。分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白為細(xì)胞核蛋白，不穩(wěn)定且具有較強的親水性。

表 2


條斑紫菜PyMFG蛋白的跨膜區(qū)分析結(jié)果如表2所示，該蛋白無明顯的跨膜α螺旋和信號肽。其二級結(jié)構(gòu)主要由13.02%的α螺旋，14.25%的β-折疊以及72.73%的卷曲構(gòu)成。同時，該蛋白含有2種、4個多功能位點，分別是長度為1的第28位的多核苷酸結(jié)合位點；長度依次為1、3、2的第35~36、321~323、369~370位氨基酸結(jié)合位點。

條斑紫菜PyMFG蛋白的結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果如圖3所示，該蛋白含有TEA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和YAP結(jié)合結(jié)構(gòu)域，分別位于ORF的Met1~Arg77區(qū)間和Glu143~Glu282區(qū)間，屬于TEA-ATTS超家族結(jié)構(gòu)域。

圖 3

圖 3 條斑紫菜PyMFG蛋白的氨基酸疏水性分析

利用Swiss-Model和Pymol對條斑紫菜單孢子形成蛋白(PyMFG)空間結(jié)構(gòu)預(yù)測該蛋白由3個α螺旋(H1/H2/H3)，9個β折疊片層以及10個環(huán)狀連接組成，且TEA結(jié)合結(jié)構(gòu)域位于H1螺旋的表面(圖4)。

圖 4

圖 4 條斑紫菜PyMFG蛋白的空間結(jié)構(gòu)模擬，H1，H2，H3為構(gòu)成此蛋白的3個α螺旋

2.3   同源序列比對與系統(tǒng)發(fā)生分析

條斑紫菜的PyMFG基因與NCBI登錄的部分產(chǎn)孢物種的孢子形成基因編碼的氨基酸多序列比對結(jié)果如圖5所示，條斑紫菜的PyMFG基因編碼的蛋白具有保守的Trp、Ser、Glu、Gln、Ala、Leu、Ile、Gly、Arg、Asn、Val、His。此外，在其編碼的第8~46位氨基酸和第62-73位氨基酸處存在2個保守區(qū)域，前者以保守的Gly和Glu為主，后者以保守的Arg、Val、Ser、Gln為主。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白的兩段氨基酸保守區(qū)域均位于TEA結(jié)合結(jié)構(gòu)域位置。

圖 5

圖 5 不同物種中孢子形成蛋白的氨基酸同源序列比對

為進(jìn)一步明確條斑紫菜的進(jìn)化情況，本研究以條斑紫菜PyMFG蛋白為基礎(chǔ)，而后從GenBank登錄的不同真菌和細(xì)菌物種中篩選出13個與孢子萌發(fā)、形成有關(guān)的蛋白進(jìn)行氨基酸序列比對后構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹如圖6所示，條斑紫菜PyMFG蛋白并未獨立于真菌分生孢子形成蛋白的亞分支，而是與構(gòu)巢曲霉、黑曲霉(Aspergillus luchuensis)聚為小支后再與葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、白色念珠菌(Candida albicans)等子囊菌門的真菌聚為一個大的亞支，Bootstrap值較大。更重要的是，條斑紫菜并未直接與細(xì)菌的不同物種相聚。

圖 6

圖 6 不同物種的PyMFG蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

2.4 PyMFG基因的差異表達(dá)分析

熒光定量PCR驗證

PyMFG基因在紫菜種間的熒光定量分析結(jié)果如圖7所示。該基因在不放散單孢子的野生型壇紫菜(WT-8)中不表達(dá)，在大量放散單孢子的野生型圓紫菜(PS-WT)、印度產(chǎn)紫菜(PC-WT)以及條斑紫菜(W’)中能夠表達(dá)且種間的表達(dá)量差異顯著。

圖 7

圖 7 條斑紫菜PyMFG基因在不同紫菜種間的相對表達(dá)量比較

PyMFG基因在條斑紫菜不同品系間的熒光定量分析結(jié)果如

圖 8

圖 8 條斑紫菜PyMFG基因在不同品系間的相對表達(dá)量比較

PyMFG基因在條斑紫菜不同品系不同日齡時的熒光定量分析結(jié)果如圖9所示，PyMFG基因在日齡為25、30、35 d的W品系中不表達(dá)；在W'品系中隨著藻體日齡的增長，表達(dá)量相應(yīng)增大；然而，在R、R'品系中的表達(dá)量相對較低。

圖 9

圖 9 條斑紫菜PyMFG基因在不同品系不同日齡時的相對表達(dá)量比較

單孢子放散

條斑紫菜4個雜交重組品系(W、R、W'、R’)在日齡為20~35天時每株葉狀體的單孢子放散總量如

圖 10

圖 10 條斑紫菜不同品系每株葉狀體的單孢子總放散量比較

信息來源：上海海洋大學(xué)