通過(guò)對(duì)PyMFG基因編碼的氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，該基因編碼的蛋白質(zhì)含有TEA和YAP結(jié)構(gòu)域，屬于TEA-ATTS超家族。該蛋白結(jié)構(gòu)域家族發(fā)現(xiàn)于轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)因子(TEF)和分生孢子發(fā)育調(diào)節(jié)因子aba中，位于真核轉(zhuǎn)錄因子的氨基末端。研究發(fā)現(xiàn)，TEAD轉(zhuǎn)錄因子家族是發(fā)育過(guò)程所必需的，其家族成員含有與DNA元件結(jié)合的TEA結(jié)構(gòu)域和與轉(zhuǎn)錄共激活因子相互作用的反式激活結(jié)構(gòu)域，與傳遞下游信號(hào)息息相關(guān)。研究表明，TEAD1可參與上皮細(xì)胞的調(diào)節(jié)分化和上皮形態(tài)發(fā)生[17]。此外，亦有研究指出，TEAD可結(jié)合更具親和力的TEF-1和TEC1位點(diǎn)，通過(guò)磷酸化一種或多種DNA結(jié)合表面的絲氨酸(Ser-65，Ser-66和Ser-76)，引入靜電排斥或空間位阻，干擾與DNA的結(jié)合，進(jìn)而調(diào)節(jié)TEA/ATTS轉(zhuǎn)錄因子活性[18]，從而激起下游信號(hào)的應(yīng)答。
研究證實(shí)，TEA-ATTS超家族結(jié)構(gòu)域中的TEF與其同源蛋白具有高度保守的真核DNA結(jié)合位點(diǎn)，與病毒基因的轉(zhuǎn)錄密切相關(guān)[19]。TEF-1可以通過(guò)N末端的TEAD結(jié)合M-CAT原件調(diào)節(jié)心臟、骨骼和平滑肌的發(fā)育且L1環(huán)是TEAD協(xié)同加載到串聯(lián)重復(fù)的M-CAT DNA結(jié)合位點(diǎn)時(shí)必需的[18]。研究發(fā)現(xiàn)，哺乳動(dòng)物中存在4種高度保守的TEAD/TEF轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)因子(TEAD1-TEAD4)，需要轉(zhuǎn)錄共激活因子的結(jié)合才可以激活DNA的轉(zhuǎn)錄調(diào)控反應(yīng)[20-21]。除TEF-1外，該家族結(jié)構(gòu)域包含參與Ty1反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子激活過(guò)程的酵母蛋白TEC1[20, 22]、控制構(gòu)巢曲霉分生孢子發(fā)育末期反饋調(diào)控回路的AbaA蛋白以及調(diào)控果蠅自身的發(fā)育分化和神經(jīng)系統(tǒng)中某些特定基因表達(dá)的SD蛋白[23-25]。目前研究發(fā)現(xiàn)，條斑紫菜單孢子形成過(guò)程與子囊菌門(Ascomycota)真菌分生孢子的形成過(guò)程極為相似。更重要的是，已有研究證實(shí)，TEA結(jié)構(gòu)域家族發(fā)現(xiàn)于轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)因子(TEF)和分生孢子發(fā)育調(diào)節(jié)因子aba中，且構(gòu)巢曲霉abaA基因的特異性表達(dá)能夠促使其產(chǎn)生分生孢子頭和維持分生孢子產(chǎn)量[26-28]。由此推斷，PyMFG蛋白的TEA結(jié)構(gòu)域與條斑紫菜單孢子形成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄密切相關(guān)。
TEAD包含N末端的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和C末端的YAP效應(yīng)結(jié)構(gòu)域，與細(xì)胞的發(fā)育分化過(guò)程密不可分[18, 29]。研究表明，YAP是Hippo途徑的末端效應(yīng)物之一，是參與核心激酶盒的最關(guān)鍵步驟，其主要作用于誘導(dǎo)增殖促進(jìn)和抗凋亡基因的表達(dá)[30-31]。然而，Hippo途徑的主要功能是抑制增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而限制器官的過(guò)度生長(zhǎng)[32]。研究發(fā)現(xiàn)，果蠅(Drosophila melanogaster)中的Hippo途徑敲除后導(dǎo)致細(xì)胞無(wú)限分裂[33]。此外，Hippo途徑還可以通過(guò)磷酸化和激活細(xì)胞質(zhì)的YAP來(lái)抑制YAP-TEAD雜合轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用[29]。更重要的是，在缺乏或阻斷 Hippo 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的情況下，未磷酸化的YAP可以進(jìn)入細(xì)胞核作為轉(zhuǎn)錄共激活因子，結(jié)合并激活TEA家族轉(zhuǎn)錄因子 TEAD或SD，進(jìn)而調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。由此推斷，YAP對(duì)TEA具有激活、促進(jìn)作用，猜測(cè)兩者在條斑紫菜PyMFG蛋白中亦具有相似功能，可能與激活單孢子形成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)密切相關(guān)。
多序列比對(duì)結(jié)果顯示，條斑紫菜的PyMFG基因所編碼的蛋白與子囊菌門的構(gòu)巢曲霉、黑曲霉(Aspergillus luchuensis)、葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、假絲酵母(Candida albicans)等分生孢子形成蛋白具有多種相同的保守氨基酸，且Gly、Glu、Arg、Val、Ser、Gln的使用頻率較高。然而，所有參與同源序列比對(duì)的物種中并未存在一種使用頻率更高的保守氨基酸。由此推測(cè)，無(wú)論是子囊菌門的分生孢子還是條斑紫菜的單孢子，其發(fā)育分化過(guò)程均需要多種必需氨基酸的共同參與，進(jìn)化水平較低。
此外，系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，條斑紫菜與構(gòu)巢曲霉和黑曲霉聚為一個(gè)小的亞支，充分說(shuō)明PyMFG基因與其分生孢子形成基因abaA在調(diào)控孢子形成方面的保守性，親緣關(guān)系密切。然而，條斑紫菜與細(xì)菌聚為的分支呈現(xiàn)極低的Bootstrap值，說(shuō)明該蛋白與細(xì)菌的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，2物種的孢子形成過(guò)程具有較大差異。
目前，關(guān)于藻類與真菌的起源進(jìn)化主要存在2種理論。一種為起源多源論，認(rèn)為藻類由于色素體的喪失，逐漸由自養(yǎng)生活變?yōu)楫愷B(yǎng)生活，從而使自身演變?yōu)檎婢Ａ硪环N理論為鞭毛生物起源論，認(rèn)為藻類和真菌起源于同一種單細(xì)胞原始水生鞭毛生物，其鞭毛數(shù)量不一，個(gè)體間葉綠素和其他色素有無(wú)、含量方面均存在差異。因此，隨著進(jìn)化時(shí)間的推移，本身具有色素的個(gè)體演化為藻類，而不具有色素的個(gè)體演化為真菌[34]。綜上所述，本研究得出的條斑紫菜單孢子形成基因(PyMFG)編碼的蛋白與構(gòu)巢曲霉、黑曲霉等子囊真菌分生孢子形成蛋白親緣關(guān)系更近的結(jié)果較為合理，為后續(xù)研究單孢子形成與放散的分子生物學(xué)機(jī)制提供了方向和理論支持。
培養(yǎng)觀察發(fā)現(xiàn)，單孢子的形成與放散是一個(gè)連續(xù)的過(guò)程，其形成或放散并不能以單一生物學(xué)過(guò)程獨(dú)立存在于其無(wú)性生殖過(guò)程中。單孢子最終放散的數(shù)量與速度取決于其形成的數(shù)量與速度，單孢子在不形成時(shí)亦不會(huì)從藻體釋放。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)熒光定量分析發(fā)現(xiàn)，PyMFG在不放散單孢子的壇紫菜(WT-8)中不表達(dá)，在大量放散單孢子的圓紫菜(PS-WT)、印度產(chǎn)紫菜(PC-WT)以及條斑紫菜(W')中表達(dá)且種間的表達(dá)量差異顯著，充分說(shuō)明該基因與單孢子形成的密切相關(guān)性。
單孢子放散實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，W品系不放散單孢子，R、W'、R'品系能夠大量放散單孢子且放散總量差異顯著。此外，PyMFG基因在父本品系(W)中不表達(dá)，與單孢子放散實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。在偏父本品系(W')中的相對(duì)表達(dá)量隨藻體日齡的增長(zhǎng)日趨增大，放散能力增強(qiáng)，與單孢子放散實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。然而，該基因在母本品系(R)與偏母本品系(R')中的相對(duì)表達(dá)量變化與兩者大量放散單孢子的性狀存在差異。推測(cè)兩品系單孢子形成和放散的基因與父本品系(W)和偏父本品系(W')存在本質(zhì)性差異，而這與其雜交母本(fre-1)發(fā)生的點(diǎn)突變息息相關(guān)。
大量放散單孢子的條斑紫菜紅色突變體(fre-1)是由野生型條斑紫菜(U-511)經(jīng)化學(xué)誘變劑甲基硝基亞硝基胍(MNNG)誘變而來(lái)[PyMFG基因在調(diào)控單孢子形成和放散時(shí)的相互作用網(wǎng)絡(luò)存在差異。由此推測(cè)，此性狀的發(fā)生至少由一對(duì)等位基因控制。
不同紫菜種間的熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)了PyMFG基因與紫菜屬的某些紅藻形成和放散單孢子的性狀密切相關(guān)。此外，本研究根據(jù)單孢子放散實(shí)驗(yàn)和熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)推斷出大量放散單孢子的條斑紫菜品系中存在大量調(diào)控單孢子形成和放散的基因，至少有1對(duì)等位基因參與調(diào)控其形成和放散，從而使上述結(jié)果存在差異。此外，條斑紫菜的PyMFG蛋白含有TEA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，與構(gòu)巢曲霉和黑曲霉的分生孢子形成蛋白AbaA屬近緣同源蛋白，可能作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子調(diào)節(jié)其單孢子的形成，為后期研究條斑紫菜單孢子形成和放散的分子生物學(xué)機(jī)制提供了方向，進(jìn)而為開(kāi)展條斑紫菜在工程菌中的表達(dá)研究和開(kāi)發(fā)合理放散單孢子的紫菜新品種提供了理論支持。然而，以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果為推斷與預(yù)測(cè)，PyMFG基因具體的分子生物學(xué)功能還需通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。